但是多数据报道，70% 的吸烟吸烟相关死亡发生在老年人中，80-90% 的患肺终身吸烟者从未患肺癌，也就是多数说约 10%-20% 的终身吸烟者患肺癌。
那么为什么会出现这样的吸烟结果呢？或许从分子和遗传机制的角度解释这些观察结果更有说服力，但目前仍然缺乏全面的患肺分子风险评估研究。
因此，多数阿尔伯特 · 爱因斯坦医学院 Jan Vijg、吸烟Simon D Spivack 和 Zhenqiu Huang 领衔的患肺研究团队，针对这个难题做了进一步研究。他们利用单细胞多重位移扩增（single-cell multiple displacement amplification，SCMDA）技术，对 33 名年龄在 11-86 岁之间、吸烟史从从不吸烟到 116 包年不等的受试者的近端支气管基底细胞（proximal bronchial basal cells，PBBCs）进行了单细胞全基因组测序，研究结果发表在 Nature Genetics（IF：41.307）。
研究结果显示，在从不吸烟者中，单核苷酸变异（single-nucleotide variants，SNV）和插入与缺失（insertions and deletions，INDEL）的频率随着年龄的增长而增加，吸烟者中的突变频率显著升高。当以吸烟年为对照时，突变跟随癌症风险呈线性增加，直到大约 23 包年（即每天吸烟的包数 × 吸烟年数），突变频率趋于稳定。突变频率的平稳可能是由于这类人群有更强大的 DNA 损伤修复系统，或解毒烟草烟雾的能力。
论文首页截图 图源：Nature Genetics
下面，我们一起来看看这个研究是如何开展的。
单核的突变频率和突变谱
为了描述突变特征，该研究纳入了 33 名受试者（19 名吸烟者和 14 名从不吸烟者），并获得了他们的 PBBCs。在 19 名吸烟者中，有 14 人被诊断肺癌，而只有 1 名从不吸烟者患肺癌。研究者从冷冻的 PBBCs 颗粒中分离细胞核，并测定 3-8 个单个细胞核的突变频率和突变谱。
从人肺中分离、处理和分析 PBBCs 的示意图 图源：Nature Genetics
从不吸烟者 PBBCs 中与年龄相关的突变积累
为了研究 PBBCs 中年龄与突变频率的关系，研究者对来自从不吸烟者的单个 PBBC 细胞核中定量分析了包括单核苷酸变异（SNV）和插入与缺失（INDEL）在内的体细胞突变，并针对基因组覆盖率和检测敏感性进行了校正。
研究发现，受试者每个细胞核的 SNV 中位数在 464±108（11 岁）和 2739±778（86 岁）之间变化，相当于每年每个细胞发生 28 个突变（P = 3.9×10−3）。此外，研究者还发现受试者每个细胞核的 INDEL 中位数随着年龄的增长而增加，从 59±18（11 岁）到 304±94（86 岁），相当于每年每个细胞大约发生 2 个 INDELs（P = 0.28）。
吸烟者 PBBCs 的突变频率
接下来，研究者研究了吸烟者 PBBCs 中随年龄增长的突变积累。研究结果与从不吸烟者相似，吸烟者细胞中的突变频率随着年龄的增长而增加，增加速率明显更高，估计为每年每个细胞发生 91 个 SNV（P = 3.5×10−2），比从不吸烟者多 63 个 SNV（P = 2.1×10−2）。
对于 INDELs，在所有受试者中均观察到突变频率随年龄的增长显著增加（P = 4.8×10−2）。然而，与同龄从不吸烟者相比，44 至 81 岁吸烟者的 INDEL 频率更高，但无统计学意义（P = 0.51）。
吸烟者 PBBCs 中的突变积累 图源：Nature Genetics
为了更好地了解吸烟和突变负荷之间的关系，研究者分析了正常 PBBCs 的突变频率与累积吸烟剂量的函数关系，吸烟剂量用自我报告的包年表示，定义为一年内每天吸烟 20 支。
研究者将突变频率建模为包年的函数，使用了负二项式混合效应模型。在没有异常值的情况下，突变频率线性增加到 23 包年（95%CI：10-51 包年）后保持不变。结果表明，重度吸烟者（>60 包年）的 PBBCs 突变频率不高于中度吸烟者（20.1-60 包年）（P = 0.11）。
测试突变频率与吸烟包年之间关系的模型 图源：Nature Genetics
对 INDEL 应用相同的方法，研究者在 23 包年发现了相同的变化点。在较重的吸烟者中这种剂量反应关系的丧失似乎表明，单凭累积突变并不能完全解释肺癌风险随包年增加而增加的原因。
除了年龄和包年的影响外，他们还研究了戒烟（戒烟年数）对突变频率的可能影响，但戒烟对 SNV（P = 0.22）或 INDEL（P = 0.76）频率没有显著影响。
A、B：INDEL 突变频率和吸烟剂量 C、D：戒烟对突变频率的影响
图源：Nature Genetics
癌症驱动基因突变
虽然体细胞突变通常是随机的，但它们可以基于对宿主细胞的选择性优势而进行扩增，这一过程在癌症研究中已有充分的报道。因此，研究者进一步分析了已知肺癌和泛癌驱动基因中体细胞突变的数据集。在来自吸烟者和非吸烟者的细胞核中观察到 100656 个体细胞突变，其中，肺癌驱动基因中 21 个突变发生在 11% 的细胞核中，泛癌症驱动基因中 111 个突变发生在 50% 的细胞核中。然而，随机基因组的排列测试表明，肺癌（P = 0.73）或泛癌（P = 0.81）驱动基因的突变在统计学上没有显著富集。
正常 PBBCs 细胞核中的癌症驱动基因突变 图源：Nature Genetics
突变特征
接着，研究者分析了与衰老或吸烟相关的体细胞突变特征。吸烟者 PBBCs 中发现单碱基替换（SBS）特征的分析揭示了 SBS4 的存在，而从不吸烟者中几乎不存在 SBS4。SBS4 先前已被证明是吸烟者肺癌的主要特征。尽管吸烟者中 SBS4 的突变数量显著更高，但它与年龄无关（P = 0.40）。SBS5 引起的突变与吸烟状态显著相关，但与实际年龄的相关性更强。从所有受试者、吸烟者和从不吸烟者中提取的其他 14 个特征与各种分子机制相关。
变异特征和吸烟 图源：Nature Genetics
肺癌的易感性与种系遗传变异有关
最后，为了评估遗传背景对 PBBCs 突变的可能影响，研究者测试了所有受试者是否存在先前与实体癌相关、并列在 Clinvar 数据库中的种系变异。在 31 名受试者中，16 名被诊断为癌症（14 名肺癌，1 名前列腺癌，1 名乳腺癌）。他们还发现，共有 17 人携带了与实体癌（肺癌、乳腺癌、结肠癌、肉瘤、淋巴瘤、前列腺癌）风险相关的六种已确定的基因突变中的至少一种。在这 17 名受试者中，13 名被诊断为癌症（11 名肺癌、1 名前列腺癌和 1 名乳腺癌）。
研究者发现，两名吸烟受试者存在 AKR1C2（编码醛/酮还原酶）基因多态性，这对 PAHs 的解毒至关重要，而且这两人突变负荷中的 SBS4 特征部分增加了 2 倍以上（P = 2.2×10−16）。这表明 AKR1C2 突变可能降低携带者对烟草烟雾的解毒作用，增加对吸烟诱发的致突变性的易感性。
与实体癌相关的种系遗传变异 图源：Nature Genetics
总结
总之，该研究对不同年龄段的吸烟者和非吸烟者进行人肺单细胞体细胞突变分析，证实了吸烟通过增加体细胞突变频率增加肺癌风险的模型，通过该模型，合理的解释了为什么大多数吸烟者从未得肺癌。
另一方面，吸烟者基因突变频率的剂量依赖性在 23 包年后趋于平稳，这表明可以通过减少突变来降低肺癌风险，例如通过提高 DNA 修复准确性或通过优化烟草烟雾的解毒来减少 DNA 损伤。
该研究为进一步评估可调节正常支气管细胞突变易感性的、内在的肺癌危险因素的性质提供了合理的依据。
本文首发于丁香园旗下专业平台：丁香园肿瘤时间
作者：贝塔_内啡肽；排版：林舒雅
(责任编辑：娱乐)